25 febrero, 2008

Investigación de manchas y costras de sangre. Parte 2: lugar del hecho y laboratorio

SISTEMÁTICA DEL LEVANTAMIENTO

Como toda evidencia, previo al levantamiento, las manchas de sangre deben ser fotografiadas ó filmadas y demarcadas. A la hora de croquizar su ubicación, se debe elegir una metodología confiable, como el uso de dos mediadas exactas desde un punto común de la mancha, referidas a un objeto inamovible de la escena. Se puede optar también, por la utilización de codificación especial, fácil de interpretar, para individualizar las impresiones. Por ejemplo, mancha de sangre por proyección (“Msp” ó “Sp”), mancha de sangre por escurrimiento (Mse/Se), etc.

Las manchas secas pueden levantarse utilizando un trozo pequeño de gasa embebido en solución salina al 0,8%, colocándolo sobre la mancha y ejerciendo ligera presión y rotación hasta completar el levantamiento, depositando luego en viales Ependorff ó tubos de vidrio, previo secado al aire (no al calor). Si la mancha es muy pequeña, se optará por removerla en algunos hilos sueltos de gasa, buscando diluir lo menos posible la mancha en el soporte.

Es importante utilizar guantes de látex al manipular las muestras para no contaminarlas.

Otra forma de concretar el levantamiento es utilizando un bisturí, raspando las costras (ubicadas sobre superficies no absorbentes), con lo que se obtiene escamas. Estas se pueden enviar al laboratorio en sobre de papel, sin necesidad de hidratar.

Si se detectan manchas en elementos fácilmente transportables, es conveniente levantar directamente el soporte y archivarlo en recipientes de vidrio ó papel.

Frente a la presencia de material absorbido en soportes porosos (tierra, arena, aserrín, etc.) lo ideal es la remoción del área manchada, en lo posible en su totalidad, por cuanto se desconoce en principio que volumen de esa muestra se podrá recuperar a partir de esos soportes.

En el caso de encontrar sangre fresca extravasada, se aspira con pipeta Pasteur, jeringa ó gotero y se deposita en vial con anticoagulante. Esto permite en la mayoría de los casos, la determinación de grupo y factor sanguíneo por técnica directa con los sueros hemotipificadores respectivos.

Cualquiera sea la técnica de recolección, se debe tener en cuenta que tratándose de material biológico es altamente probable su descomposición si transcurre un lapso prolongado entre el levantamiento y la remisión al laboratorio, lo que hace necesario proceder al secado de las muestras antes de su envío, lo cual debe hacerse al aire (no al sol) hasta su total secado.

Es preferible la utilización de sobre ó bolsas de papel antes que las de nylon para el envió de muestras, ya que en este último es frecuente la condensación de la humedad interior, con lo cual se estaría creando un micro-ambiente óptimo para el desarrollo microbiano.

OTROS ENSAYOS PRESUNTIVOS

Todos se basan en la capacidad potencial que posee el grupo “hemo” de la hemoglobina de ejercer actividad peroxidasa. Aportando al sistema reaccionante agua oxigenada (peróxido de hidrógeno), se induce el desprendimiento de oxígeno por descomposición del peróxido, el cual actúa sobre un sustrato orgánico reducido (bencidina, fenolftaleína, luminol, etc.) transformándolo en su forma oxidada cromática.

Grupo Hemo de la Hemoglobina

—La fenolftaleína no es soluble en agua, con lo que normalmente se disuelve en alcohol para su uso en experimentos.Es un acido débil que pierde cationes en solución. La molécula de fenolftaleína es incolora, en cambio el anión derivado es de color rosa. Cuando se agrega una base, la fenolftaleína pierde cationes formándose la fenolftalina y haciendo que tome coloración rosa. Es decir, la fenolftaleína es un indicador de pH que en soluciones ácidas permanece incoloro, pero en presencia de bases se torna rosa o violeta: utiliza el reactivo conocido con el nombre de Kastle-Meyer.

Si al aplicar unas gotas del reactivo, aparece color rosa-violeta, presuntamente es sangre. Si continúa incoloro, es negativo absoluto.

— El ensayo que utiliza el reactivo de Adler recurre a la solución de Bencidina en medio acético ó etílico. En presencia de sangre, al azul verdoso, por formación de azul de bencidina. El uso de este reactivo está casi totalmente descartado debido a sus características cancerígenas.

— El Luminol, un derivado del ácido ftálico (3-aminonaftilhidracina), es un sólido verdoso poco soluble. Su mayor importancia reside en la reacción de quimo-luminiscencia que da con peróxidos en presencia de complejos de hierro como catalizadores.

Es una prueba muy popular usada para la visualización de manchas tan diluidas que son invisibles al ojo desnudo. Esta pericia es altamente sensible a la presencia de manchas que han sido limpiadas. También se emplea para visualizar huellas sanguinolentas de zapatos dejadas en la escena del delito.

Este popular producto puede ser preparado en laboratorio ó bien adquirido en su preparación comercial. La primera posibilidad presenta la dificultad de ser difícil de preparar y estabilizar, por lo que normalmente se adquiere comercialmente. En cualquiera de los casos, el Luminol se aplica por aspersión sobre la zona donde se cree puede existir un rastro de sangre, de donde viene su principal ventaja: se puede aplicar en extensas superficies, detectando sangre hasta a nivel de trazas.


Fotocomposición que muestra una mancha latente
de sangre reactivada con Luminol


DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL DE LA ESPECIE

Reacción de Inmunoprecipitación, Inmunodifusión u Test de Ouchterlony. Un animal contiene y puede tolerar sólo un tipo de proteína. Si se le inyectan proteínas de otra especie, como la humana, se pone en acción un mecanismo de respuesta inmunológica: genera anticuerpos específicos que se unirán a las proteínas extrañas, dando como resultado macro-complejos en forma de redes tridimensionales. De este modo se generan conglomerados de alto peso molecular que decantan de la suspensión.

En la práctica se inyecta un animal, generalmente un conejo, suero humano empleando técnicas apropiadas de inmunización. Cuando el conejo haya formado suficiente cantidad de anticuerpos contra las proteínas inyectadas se procede al sangrado, separación del suero animal y convertido en antisuero contra la especie particular cuyo suero sanguíneo se utilizó en la inyección.

El ensayo se lleva a cabo en un medio geloso, utilizando gel de agar (derivado de proteínas que tiene la capacidad de absorber agua). Se utiliza esta técnica porque no “consume” mucha muestra en su realización. Se basa en la búsqueda de proteínas humanas específicas.

Además, el método es reproducible (por su estandarización); fácil operatoria; confiabilidad (a pesar de tener falsos positivos y negativos, ya que estos son conocidos y previsibles la medidas a tener en cuenta); el equipo de laboratorio necesario no es complejo.

El agar es un medio semisólido y en el mismo pueden difundir determinadas moléculas. Al encontrase antígenos con anticuerpos, se produce lo que se denomina “reacción primaria” de “interacción”, y evoluciona a una secundaria de “precipitación” por formación de las mallas tridimensionales mencionadas. La orientación de la precipitación, en este test, no está dirigida, se hace libremente.

Luego de preparar el soporte y sembrar las muestras, se incuba en una caja de Petri; dentro de la misma, además, se debe colocar un algodón embebido en agua (cámara húmeda) para que no se deshidrate el agar, se tapa y se coloca a 37-40º C. El tiempo estimado de incubación es de unas 2-2 ½ horas.

Pasado ese tiempo será visible la difusión, que se produce en forma radial.

Si la muestra es humana, se observarán cuatro (4) arcos de precipitación, evidenciando las reacciones antígeno-anticuerpo y de precipitación; si las muestras no son humanas, sólo aparecen arcos en los testigos, salvo algunos casos, como los equinos y los primates, pero en esos supuestos los arcos no se intersecan.

Método Electroforético. Se intenta movilizar una ó más especies orgánicas cargadas a través de un soporte mediante la aplicación de un campo eléctrico externo.

Los cationes presentes en la fase líquida constituyente del gel generan un flujo electroendosmótico hacia el cátodo a través del soporte. Al pH de trabajo (8,6) las proteínas séricas se cargan negativamente.

Las muestras objeto de ensayo se ubican en pocillos próximos al cátodo y el antisuero en el lado correspondiente al ánodo.

Aplicando el campo eléctrico, el movimiento de los reactantes es la resultante del concurso de las fuerzas ejercidos por el flujo electroendosmótico que arrastra las moléculas del antisuero, constituidas predominantemente por fracción gamma (hacia el cátodo -negativo-), mientras que las fracciones constitutivas del antígeno (muestras) son llevadas en el sentido de circulación de corriente (hacia el ánodo -positivo-).

El sector entre las cubetas en el que las especies reaccionantes contacten en proporciones equivalentes evidenciará la presencia de las bandas de precipitación características.

Método de Inmunocromatografía: tiene un parámetro de detección de la hemoglobina entre 140-500 ng./ml., por lo tanto las muestras para este ensayo deben estar diluidas adecuadamente.

El procedimiento es el siguiente: se colocan por la ventana 4 a 5 gotas de muestra (unos 10µL) con micropipeta. Al transcurrir la reacción, el frente cromatográfico avanza en dirección a la ventana C. La lectura de resultados debe hacerse a los 10-15 minutos de depositar la muestra Si aparecen dos (2) líneas (en C y T) el análisis es positivo para sangre.

Este examen se basa en la detección de la hemoglobina de la sangre utilizando un anti-suero específico, sembrado en la membrana de nitrocelulosa en esa zona (T).

HEMOTIPIFICACIÓN. GRUPO SANGUÍNEO

El grupo sanguíneo es un sistema de clasificación de la sangre humana basado en los componentes antigénicos de los glóbulos rojos. El más importante de los diversos sistemas de clasificación de la sangre es el del grupo sanguíneo ABO. Los cuatro tipos sanguíneos que se contemplan en esta clasificación son el A, el B, el AB y el O.

Esta se basa en la presencia en los glóbulos rojos de ciertos antígenos naturales, denominados aglutinógenos A y B, y de la presencia, además, de ciertos anticuerpos ó aglutininas específicos de cada antígeno. Cuando uno de estos aglutinógenos está ausente en los glóbulos rojos de una persona, su correspondiente aglutinina está presente en el suero.

Por ejemplo, las células sanguíneas del grupo A tienen el antígeno A en su superficie. Además, la sangre de este grupo contiene anticuerpos contra el antígeno B presente en las células rojas de la sangre del grupo B. Si se transfunde sangre del grupo “A”, a una persona del grupo “B”, los anticuerpos anti-A del receptor destruirán los glóbulos rojos de la sangre transfundida. Como los eritrocitos de la sangre del grupo O no contienen ningún antígeno en su superficie, la sangre de este grupo puede ser empleada con éxito en cualquier receptor. Las personas del grupo AB no producen anticuerpos, y pueden por tanto recibir transfusiones de cualquiera de los cuatro grupos. Así, los grupos O y AB se denominan donante universal y receptor universal respectivamente.

La especifidad antigénica está determinada por el monosacárido terminal reducido de la cadena. Ese azúcar inmuno-dominante será el mayor punto de contacto con el sitio de combinación de la aglutinina correspondiente.

Es decir, el espectro antigénico presente en la membrana del eritrocito maduro determina un poliformismo significativo entre individuos; la existencia de estos haloantígenos hace permisiva la tipificación serológica de una muestra de sangre.

Las muestras de sangre en las que los eritrocitos mantienen su integridad de membrana se estudian por pruebas directas.

Si la muestra está deshidratada, con visible desorganización de la membrana globular, la hemotipificación es indirecta, por cuanto la evidencia del antígeno presente en los fragmentos de membrana se logra con el auxilio de paneles de glóbulos rojos intactos de grupos conocidos.

Método Directo por Reacción de Aglutinación. En sangre fresca la presencia ó ausencia de un antígeno se determina por la aglutinación ó no de los glóbulos rojos puestos en contacto con un antisuero específico. Los complejos formados son de mayor tamaño que en la reacción de precipitación y el resultado puede ser visualizado a simple vista.


Para la hemotipificación, partimos del supuesto de que existen glóbulos enteros en la muestra, es decir, que la muestra es fresca. Se coloca en un porta-objeto una gota de sangre y una de solución fisiológica. Se mezclan y se observan a 10x de aumento. En el campo del micro se ven pequeños glóbulos rojos. Se agrega el antisuero a tres (3) muestras, una por cada grupo (anti-A, anti-B y anti-H) y se observa la aparición de la aglutinación mencionada.

Sistema Rhesus. Para la determinación del “Factor Rh” se procede de forma similar, utilizando el antisuero “anti-D”. A diferencia del sistema ABO y algunos otros, los antígenos del sistema “Rhesus” están confinados en la superficie del hematíe.

Se conocen tres nomenclaturas para los factores integrantes de este sistema. Actualmente se postula que la presencia de los antígenos Rh está determinada por un complejo conformado por dos genes estrechamente relacionados. Mientras que los estudios bioquímicos revelan la presencia de los factores D, C/c y E/e en por lo menos tres diferentes polipéptidos, los estudios moleculares sólo revelan dos genes estructurales: RhD y RhCE. Los sujetos Rh(+) son portadores de ambos genes mientras que los Rh(-) sólo poseen el RhCE.

El factor D es marcadamente más inmunogénico que los otros, por tal motivo, al tipificar, se evalúa la presencia ó ausencia de este factor, clasificando al sujeto como Rh(+) ó Rh(-).

Método Indirecto: Método de Absorción-Elusión. Se conoce con este nombre en referencia a los dos procesos sustanciales que se ponen en juego durante la prueba, esto es, la absorción de los anticuerpos componentes de los hemoclasificadores por parte de los determinantes antigénicos de grupos retenidos en hilos de gasa y su elusión posterior por acción del calor.

Se inicia produciendo de los restos semi-degradados de pared celular de los glóbulos rojo en hilos de gasa; tras esto, se contactan los hilos manchados con los hemoclasificadores especifidad anti-A, anti-B y anti-H en pocillos separados de una placa de toque de porcelana, es decir, a un grupo de hilos con el hemoclasificador anti-A, otro con el anti-B y otro con el anti-H.

Tras estos, los anticuerpos que no hayan presentado reacción se eliminan mediante 2 lavados consecutivos de los hilos con fisiológica. Luego, se eluyen por calor los anticuerpos fijados haciéndolos reaccionar con paneles de glóbulos rojos testigos del correspondiente grupo sanguíneo. Es decir, si en la placa se había contactado con suero anti-A, se pondrá en contacto con glóbulos rojos testigos del tipo “A”. Esto asegura que, si al principio en el hilo había restos de pared celular correspondiente al tipo A, los anticuerpos anti-A se adhirieran a estos y no otros. Luego, al poner en contacto estos anticuerpos fijados al hilo con paquetes de glóbulos rojos de tipo A, resultará la aglutinación, la cual puede verse con 10x de aumento

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Investigación de manchas y costras de sangre. Parte 1: en el lugar del hecho.

BIBLIOGRAFÍA Y SITIOS WEB CONSULTADOS Y RECOMENDADOS

CARO, P. y otros. (2004). Manual de química forense. Buenos Aires: La Rocca.

SIEGEL J., KNUPFER G., SAUKKO P. (Ed.)(2000) Encyclopedia of forensic sciences, Three-Volume Set, 1-3. Ed. Elsevier.

Varios Autores. (1983). Tratado de criminalística. Tomo II. Buenos Aires: Editorial Policial.

http://www.criminalística.net

http://www.fbi.gov/hq/lab/fsc/current/backissu.htm

La mejor forma de encubrir un crimen es con una investigación deficiente...

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Mi nombre es Carlos Sosa, Licenciado en Criminalística, estudiante de la Lic. en Accidentología Vial de la Universidad Autónoma de Entre Ríos (UADER), Entre Ríos, Argentina.

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Carlos F. Sosa

Lic. Criminalística

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